类器官培养扫盲篇：入门流程和关键操作一次讲清
发布时间:2026-03-03 10:09:43 阅读次数: 次
经作者允许，文章转自微信公众号《老熊精读医学生物文献》
一、先搞懂两个概念：类器官 vs 球状体
初次接触类器官的同学，很容易混淆两个东西：类器官Organoid和球状体Spheroid，在三维培养方面，球状体和类器官常常放在一起讨论，但两者并不完全相同。
1. 什么是类器官？ 简单说，类器官是在实验室里培育出的、具有三维结构的微型组织。它最大的特点不是一堆细胞，而是能像真实器官一样自我组织，形成具有特定空间结构和功能的复杂单元。你可以把它理解为：利用干细胞（种子细胞）或直接从组织中取出的细胞，在培养皿中为它们创造了一个接近体内的生长环境。这些细胞会自己按照发育程序，长成类似大脑、肝脏、肠道、肾脏等器官的复杂结构. 2. 什么是球状体？ 球状体培养相比于类器官培养要更基础，是将原代细胞或肿瘤细胞系通过自发聚集形成简单的球形或多细胞团块。球状体保留了三维结构及一定的组织特异性功能。培养方法也相对简单，不依赖细胞外基质（ECM）支架，细胞可通过自身相互作用自然聚集形成球状结构。常见的球状体培养方法包括悬滴法、超低吸附培养板、水凝胶、旋转培养等。与传统单层培养相比，球状体培养更能反映体内细胞的生理特性，因此广泛应用于肿瘤生物学研究和高通量药物筛选。 所以一句话总结就是球体是简单聚集的细胞球，结构单一；类器官是能自我组织的迷你器官，更好地模拟体内生理环境，结构复杂，培养难度也更高。 二、类器官的种子从哪来？
类器官的培育核心就是种子细胞，也就是干细胞，这类细胞能自我更新，还能分化成不同类型的细胞。目前常用的种子细胞主要有两类：
1. 患者来源细胞（患者来源类器官，PDOs） 直接用患者的组织（健康或肿瘤组织）培育，这些细胞本身就带有组织记忆，在合适的因子（如激活Wnt信号）刺激下，能自我更新并形成类器官。因此能保留患者器官的原有特征，包括成熟组织的表型、复杂的细胞异质性和患者特异性疾病状态。它的细胞来源遗传多样性高，还能构建生物样本库，且培育周期较短，是疾病建模（尤其是癌症）和个性化药物筛选的常用模型。与患者来源异种移植模型（PDX）相比，PDOs 成本更低、通量更高，且避免了动物实验相关的伦理问题。 2. 多能干细胞（胚胎干细胞ESC/诱导多能干细胞iPSC） 诱导多能干细胞（iPSC）是通过重编程体细胞得到的，胚胎干细胞（ESC）来自囊胚的内细胞团，两者都能分化成多种细胞类型。多能干细胞来源类器官的建立依赖于对 PSC 的定向分化，该过程包括特定胚层的形成，以及在培养过程中添加特定生长因子、信号分子和细胞因子以引导细胞分化和成熟。PSC 来源的类器官通常包含多种细胞类型，如间充质细胞、上皮细胞和内皮细胞。iPSC 类器官已成为体外模拟多种人类疾病的重要工具。 然而，PSC 来源类器官常出现增殖能力下降、成熟度不足的问题，多停留在类似胎儿阶段的未成熟状态，因此更适用于器官发生研究。相比之下，ESC 来源类器官成熟度更高，可模拟器官发生后期阶段，但其来源涉及显著的伦理争议。 三、类器官培养常用方法
1. 浸没培养 这是最常用的一种方法。简单说，就是把将细胞或细胞团嵌入细胞外基质凝胶里，再倒入含有多种营养成分、细胞因子的培养基，让细胞在凝胶里生长发育。凝胶的作用很关键，既能给细胞提供支撑，又能传递生长信号；培养基则需要根据不同器官的需求调整配方，比如添加表皮生长因子、Wnt3A蛋白等，引导细胞分化。 2. 气液界面（ALI）培养 这种方法主要用于培育胰腺、胃肠道类器官。具体操作是把组织包嵌入胶原基质中，基质底部接触液体培养基，顶部暴露在空气中，模拟呼吸道或肿瘤组织的生理环境。它的优势是能提高细胞的氧气供应，还能同时培养类器官和基质细胞，尤其适合肿瘤类器官的培养，能更好地保留肿瘤的免疫微环境。 3. 旋转生物反应器培养 这个方法属于更先进的培养技术，用旋转的容器来培养细胞。通过平衡离心力和重力，让细胞在容器里悬浮生长，模拟微重力环境。这种方法具有低剪切力、高氧传递效率及低营养梯度等特点，可促进类器官的均一生长与分化，并减少静态培养中的代谢梯度，适合用于细胞和组织工程的研究。 四、类器官培养的常规流程 Step 1：二维预培养 先通过二维培养让细胞增殖至合适数量。 Step 2：三维类器官构建 通常先把细胞和基质胶（Matrigel）预混合，在室温下将混合液滴加到24孔板中，再放入培养箱使液滴形成圆顶状结构Matrigel domes。之后加入培养基，培养7天以上，促进细胞生长分化成特定组织（脑、肠道、肺等）。培养基中会包含细胞外基质蛋白和多种生长因子，具体成分根据目标组织类型调整。
Step 3：类器官培养维持
这个过程很漫长，可能需要更换多种不同配方的培养基。培养期间，要定期看细胞状态。
Step 4：监测与表征
实验开始前，需要先确认类器官是否具备目标组织结构和分化状态，涉及操作不限于
■ 抗体染色：通过整体染色或石蜡包埋切片染色，进行ICC/ IHC分析，需使用经类器官分析验证的抗体（如SARS-CoV-2相关抗体ACE2、TMPRSS2）；
■ 核酸提取：用试剂盒或组织特异性试剂盒制备测序样本（RNA-seq、单细胞RNA-seq等），可将解离后的类器官与TRI试剂混合，-80℃冻存备用；
■ 检测分析：用专用试剂盒做细胞活力检测（Calcein-AM染活细胞、PI染死细胞），通过Forskolin诱导肿胀实验检测CFTR功能等等。
Step 5：成像与三维分析
■ 明场成像：作为基础补充手段，可快速观察类器官的整体形态、大小均一性及表面状态，确认无明显坏死、塌陷等异常，适合用于成像前的初步筛查，无需荧光标记。
■ 共聚焦成像：对类器官逐层扫描，获取不同深度的图像，检测内部细胞排列、组织架构及特异性标志物表达；同时可量化荧光强度、阳性细胞比例、类器官体积等指标。
五、类器官培养完有什么用？ 这一部分我们在前文中已经详细介绍了，这里只做简单概括： 1. 发育生物学研究 类器官能模拟器官的发育过程，比如用脑类器官研究人类大脑的形成机制，用肠道类器官探索胚胎时期肠道的发育规律。 2. 疾病建模 这是类器官的主要应用。比如把感染了幽门螺杆菌的细胞培育成胃类器官，模拟幽门螺杆菌感染人体的过程，研究致病机制；用CRISPR编辑过的细胞培育肾类器官，可用于研究遗传性肾病的发病原因；而肿瘤类器官能保留原发肿瘤的关键遗传和表型特征，以及肿瘤内异质性，可模拟肿瘤的生长、侵袭过程。 3. 药物研发与毒性测试 传统药物筛选常用单层细胞或动物模型，结果和人体实际情况存在差距。类器官能更真实地模拟人体器官的反应，用来测试药物的疗效和毒性。比如用肝类器官测试药物的代谢情况，用肿瘤类器官筛选有效的抗癌药物。 4. 精准医疗 对于患者来源类器官（PDOs）来说，这是最有价值的应用。可以从患者身上取少量组织，培育出专属的类器官，然后用它测试不同药物、不同剂量的治疗效果，找到最适合该患者的治疗方案。肿瘤类器官能有效预测患者对化疗的反应，为临床治疗提供参考。 六、类器官培养的常见疑问解答 1.基质胶（Matrigel）是必需的吗？ of course，基质胶是类器官生长的关键。它能提供必要的化学信号（细胞因子）和结构性细胞外基质蛋白，模拟体内三维微环境。通常使用未稀释的高浓度基质胶（≥8mg/mL）构建Matrigel domes，少数高通量培养会用稀释后的基质胶。 2. 怎么去除基质胶？ 传代时1100 rpm，5min离心后，基质胶会形成一层薄膜覆盖在细胞沉淀上，小心吸弃即可。之后用培养基或PBS清洗细胞，再次离心就能彻底去除残留基质胶。 3. 类器官可以冻存吗？ 传代：可以按小细胞团块的形式传代，也可以使用机械分离/无酶传代试剂以单细胞形式传代。根据类器官的类型和汇合度，传代时可使用大约1:3-1:4的传代比例。 冻存：大部分类器官（尤其是PDOs）可冻存，少数成熟的iPSC衍生类器官（如肺类器官）冻存难度较高。冻存前需用ROCK抑制剂预处理，将约5-10个Matrigel domes（细胞密度约90%）放入一个冻存管，用程序降温盒冷冻。 4. 类器官培养基有什么讲究？ 类器官需要无血清专用培养基，核心成分包括基础培养基（如高级DMEM/F12）、添加剂（N-2、B27、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸等）、生长因子（WNTs、R-Spondin-1、Noggin、成纤维细胞生长因子FGFs、表皮生长因子EGFs等），以及小分子抑制剂等。 5. 类器官能培养多久？ 只要培养条件合适，类器官中能持续保留具有自我更新能力的干细胞（如 LGR5⁺ 细胞），就可以反复传代、长期培养，但需要定期做质量检测，避免在培养过程中发生变化。